لاله واژگون

لاله­ واژگون از منحصر­بفرد­ترین گونه گلها و گیاهان بومی و وحشی مناطق کوهستانی ایران است. این گونه گیاهی در ارتفاعات سردسیر کهکیلویه و بویراحمد، اشترانکوه لرستان، کوههای صمصامی چهار محال و بختیاری و گلستان کوه در خوانسار، در سطح وسیع و قابل توجهی می روید، که به عقیده گیاه شناسان، این گل سربه­زیر به سرعت در حال انقراض بوده و زیستگاه و تعداد این گونه گیاهی بسیار کم شده است.

این گونه مقاومت زیادی در برابر سرما و سازگاری ویژه­ای با دامنه­های سنگلاخی و صخره­ای دارد و چنانچه زیستگاه این گل به وسیله انسان و دام تخریب نشود، توانایی پوشاندن عرصه­های وسیعی از طبیعت را با رویش هزاران شاخه زیبا دارد. گیاه لاله واژگون از جمله گیاهان در خطر انقراض کشور است که هرساله به دلیل برداشت غیر قابل کنترل گل و پیاز از رویشگاه­های طبیعی، بیش از پیش در معرض نابودی قرار دارد. از دست دادن این نعمت بزرگ که از میلیون­ها سال پیش به ما به ارث رسیده است، ضایعه­ای بزرگ خواهد بود.  با توجه به ضرورت حفظ این نوع گونه­های بومی، در این پژوهش سعی شده است تا گامی هر چند کوچک در جهت روش ازدیاد به منظور حفظ لاله واژگون برداشته شود. امید است این کوشش بتواند گامی در راستای حفظ محیط زیست و منافع ملی تلقی شود. بدون تردید برداشتن گامهای بلند در آینده توسط متخصصان، در گرو بهره­گیری از یافته ­های کوچک خواهد بود. به امید آن روز.

 

fritillaria-imperialis4

در ایران لاله واژگون تحت تاثیر دمای هوا از اوایل بهار در نواحی شمالی زاگرس شروع به شکوفایی می­کند و در مناطق جنوبی در اواسط تابستان به گل می­نشیند.  لاله واژگون تا ۱۰۰ سانتی­متر از سطح زمین ارتفاع دارد و عمر این گیاه بسیار کوتاه است  .از اوایل اردیبهشت ماه گلدهی این گیاه شروع و در پایان فصل بارش تمام می شود. این گونه بوته­ای در منطقه حفاظت شده مانشت (ارتفاعات شمال شهر ایلام) از اوایل اردیبهشت ماه تا اواخر خرداد ماه در دو رویشگاه تنگ دالاب و دامنه کوه مانشت رشد می­کند.

در ایران براساس سیاست­های سازمان حفاظت محیط زیست، لاله واژگون به عنوان ذخیره ژنتیکی و عنصر زیبایی شناختی قلمداد می­گردد و به همین دلیل حفاظت از آن ضروری است. با توجه به شرایط موجود (پراکنش محدود و متراکم) به اضافه چرای دام­ها، جاده سازی، بوته­کنی، برداشت گل و سوخ، قاچاق گل و عرضه به بازار، به نظر می­رسد که بقای لاله واژگون در آینده با چالش روبه­رو گردد. بر اساس مصوبه شماره ۱۵۰ مورخ ۲۷/۱۱/۷۵ شورای عالی محیط زیست، وضعیت لاله واژگون نگران کننده اعلام شده است.

شدت چرا دام ها در برخی مناطق به حدی است که گل‎دهی سال بعد را با مشکل مواجه می‎کند زیرا لاله واژگونکه اندام هوایی خود را سریع از دست می‎دهد از ذخیره غذایی کافی برخوردار نبوده و در نتیجه گل سال بعد از کیفیت چندانی برخوردار نخواهد بود و چنانچه در سالهای متوالی این تخریب صورت پذیرد گیاه گل‎دهی طبیعی نخواهد داشت.

 

 اهمیت زینتی

لاله واژگون از گل­های بهاری است که به طور طبیعی در ماه­های فروردین و اردیبهشت گل­ می­دهد و گل­های آن بسیار جذاب و با عمر کوتاه است. اگر سوخها در دمایی غیر از آنچه که در محیط طبیعی دریافت می­کنند، قرار گیرند ممکن است تاریخ گلدهی آن تغییر نماید.

لاله واژگون را از زیباترین گیاهان زینتی دنیا می‎دانند که بازارپسندی بالایی را دارا می‎باشد و بازارهای کشورهای اروپایی و آمریکایی توجه خاصی به این گیاه نشان می­دهند. این گل به دلیل دارا بودن ساقه‎های بلند و قوی می­تواند به عنوان گل شاخه­بریدنی به اقصی نقاط دنیا صادر شود. به علاوه شکل و رنگ و اندازه گل در لاله واژگون بسیار زیبا و مناسب برای پارکها و باغها است و می‎تواند رقیبی جدی برای لاله‎ها و سنبل‎هایی باشد که اکنون در تمامی نقاط جهان کشت و کار می‎شوند. لاله واژگون قابلیت فروش به صورت گیاه گلدانی را نیز دارا است.

لاله واژگون F. persica و  F. imperialisاز مهمترین گیاهان صادراتی ترکیه به حساب می­آید و بیش از ۱۰۰ سال است که به طور وسیع به بازارهای هلند و به میزان کمتری به بازارهای آلمان، انگلستان، آمریکا، ژاپن و دانمارک ارسال می­شود.

امروزه هر عدد سوخ F. imperialis در فروشگاه­های اینترنتی ۶ تا ۱۲ دلار به فروش می­رسد.

 

اهمیت دارویی

لاله واژگون به دلیل داشتن خاصیت خلط آوری و ضدسرفه ، بیش از ۲۰۰۰ سال است که در طب سنتی چین مورد استفاده قرار می­گیرد . ترکیبات شیمیایی موجود در لاله واژگون به­طور گسترده مورد بررسی قرار گرفته­اند که از جمله آنها می­توان به آلکالوئیدها، ساپونین­ها، ترپنوئیدها، استروئیدها، اسید سوکسنیک، تیمیدین و آدنوزین  اشاره نمود.  همچنین بنا به گزارش­ها، Fritillaria دارای فعالیت مهار تجمع پلاکت خون است. F. imperialis برای درمان بیماری­های مختلف از جمله گلو درد، سرفه، آسم، برونشیت، سل، غدد لنفاوی گردن، غدد تومور و سوزش ادرار استفاده می­شود.

در بررسی ترکیبات شیمیایی سوخ­های لاله واژگون، ۸ نوع آلکالوئید استروئیدی شامل آلکالوئیدهای Epeiedine،Ebeiedinone ، Isoverticine،Verticine ،Verticinone ،Hupehenine ، Ebeienine و  Imperialineشناخته شده­اند که ترکیبات اصلی و فعال گونه­های مختلف Fritillaria را تشکیل می­دهند.

در مطالعه­ای تحت عنوان بررسی اثر ضد دردی عصاره آبی سوخ گیاه لاله واژگون در موش و مقایسه آن با مورفین مشخص گردید که عصاره آبی سوخ گیاه لاله واژگون دارای اثر ضد درد می­باشد. تصور می­شود وجود اثر ضد دردی این گیاه مربوط به حضور آلکالوئیدهای impericine و forticine باشد.

 

ازدیاد

 ازدیاد جنسی

Fritillaria به وسیله بذر نیز ازدیاد می‎یابد. در تابستان هنگامی که کپسول بذر شروع به قهوه‎ای شدن کرد، قبل از باز شدن، بذور جمع­آوری شده و در محل خشک و دارای تهویه نگهداری می­شوند. بذرهای جمع‎آوری شده در پاییز کشت می‎گردند تا سوخ تولید شود. در این حالت در شرایط مناسب حدود ۵ تا ۶ سال زمان مورد نیاز است تا سوخی که توانایی تشکیل گل را دارا باشد ایجاد گردد. به علاوه گیاهان حاصل از بذر به دلیل دگر­گرده افشانی گونه­های Fritillaria شبیه والدین نخواهند بود.

 

ازدیاد رویشی

مطالعات قبلی نشان داده است که F. imperialis را نمی­توان به طور سریع و موثر به وسیله روش­های سنتی مثل فلس برداری یا تقسیم سوخ ازدیاد کرد. استفاده از این روش­ها به­دلیل کم بودن تعداد فلس­ (۵-۳ عدد) به ازای هر سوخ و در نتیجه محدود بودن سلول­های مریستمی، دارای نرخ ازدیاد محدودی است.

 

 فلس‎برداری

پس از جدا نمودن فلس از قسمت­ های اصلی می­توان آن را درون خاک قرار داد. با این روش، هر جوانه موجود در فلس­ به سوخ تبدیل می­شود. فلس­ها می­توانند مستقیماً ریشه بدهند، اما اگر به مدت ۶ هفته در ماسه مرطوب، پیت یا ورمیکولیت مرطوب در دمای ۱۸-۲۰ درجه سانتی­گراد قرار بگیرند، نتایج بهتری به دست می­آید (هارتمن و همکارن، ۲۰۰۱).درصورتی که سوخ­ها به صورت افقی برش داده شوند و با چاقوی مخصوصی خراش داده شوند قابلیت باززایی سوخچه­ افزایش پیدا می­کند. در گونه F. imperialis سوخهای تجاری پس از ۳ سال به دست می‎آیند.

 

 رشد و نمو و گلدهی

دوره خواب  Fritillariaخیلی کوتاه است و دوره رشد گیاه می‎تواند از اواسط مرداد ماه شروع شود. به همین دلیل ضروری است که سوخ­ها در اواخر تابستان یا اوائل پاییز کشت شوند، در غیر این صورت سوخ­ها در انبار شروع به ریشه­دهی می­نمایند. در اروپای غربی گلدهی در بهار آغاز شده و گیاهان در تیرماه پیر می‎شوند. لاله واژگون دارای یک خواب کوتاه مدت ظاهری پس از خشک شدن اندامهای هوایی است و در اوائل پاییز رشد آن شروع می‎شود و ریشه‎ها و جوانه‎ها شروع به رشد می‎نمایند )دی هرتوگ و لی نارد، ۱۹۹۳(. کیفیت و اندازه گل در F. persica به ­طور مستقیم به محیط و وزن سوخ بستگی دارد.

سوخهای لاله واژگون را به طور معمول نمی‎توان پیش‎رس کرد اما تسریع گل‎دهی گیاه ‎گلدانی امکان‎پذیر است. معمارمشرفی (۱۳۷۷) اثر  سرما، جیبرلین و تاریخ کشت در بهبود کمی و کیفی و پیش رس کردن را در F. imperialis مورد بررسی قرار دادند. نتایج این تحقیق نشان داد سوخهایی که تیمار یک ماه سرما را دیده­اند پیش­رس شدن گل­ها در آنها شدید بود. همچنین تیمار یک ماه سرما نه تنها در صفات زایشی بلکه در صفات رویشی مانند تعداد برگ و ارتفاع بوته اثر داشت، تیمار جیبرلین به غلظت ppm200 گلدهی لاله واژگون را افزایش داد و سقط جوانه گل را به مقدار زیادی کاهش داد. همچنین جیبرلین باعث افزایش طول و عرض گلبرگها و تعداد گل و وزن سوخ و سوخچه‎ها گردید. تاریخ کاشت لاله واژگون نیز در پیش­رس شدن گل موثر بوده است. برای بهبود وضعیت رویشی و بالا بردن کمیت و کیفیت گلدهی و ارائه گل خارج از فصل، استفاده از ترکیب تیمار سرمایی و جیبرلین در زمان مناسب پیشنهاد شده است.

 

کشت درون شیشه­ای

کشت درون شیشه­ای شامل کشت انواع بافت­ها، سلول­ها و اندام­های گیاهی تحت شرایط سترون و در محیط­های غذایی کنترل شده است. قابلیت باززایی بافت­ها و اندام­ها و توانایی ازدیاد آن­ها مدت­هاست که شناخته شده است. طی قرن­ها، باغداران با قلمه­زنی گیاهانی که دارای صفات مطلوب بوده­اند، از توانایی ارزشمند باززایی، برای ازدیاد گیاهان بهره گرفته ­اند.fritillaria-imperialis3

اولین آزمایش کشت بافت توسط هابرلند در بین سال­های ۱۸۹۸ تا ۱۹۰۲ انجام شد که حدود ۱۰ سال قبل از آغاز کشت سلول­های جانوری بوده­ است. هابرلند موفق شد سلول­های جدا شده از مزوفیل برگ را به مدت طولانی زنده نگه دارد ولی به دلیل این که محیط کشت او ساده و فاقد هورمون­های گیاهی بود، تقسیم سلولی در برگ صورت نگرفت. در اوایل قرن بیستم با پیشرفت روش گندزدایی و مشخص شدن نیاز به ویتامین­های گروه B و هورمون اکسین در کشت­های درون شیشه­ای، نخستین آزمایش موفق در زمینه القا­ی رشد و تقسیم سلولی توسط وایت (۱۹۴۳) انجام شد. او ریشه­های جدا شده­ی گوجه­فرنگی را در محیط گندزدایی شده مستقر کرد. تا­کنون کشت درون شیشه­ای بیش از ۱۰ هزار گونه گیاهی با موفقیت انجام شده است.

از اولین تحقیق هابرلند که تلاش برای کشت بافت گیاهی بود، بیش از یک صد سال می­گذرد. بعد از کشف هورمون­های گیاهی (اکسین در دهه ۱۹۳۰ و سایتوکنین در دهه ۱۹۶۰) و سنتز شیمیایی تنظیم کننده­های رشد گیاهی و متعاقب آن گسترش محیط­های غذایی در دهه ۱۹۶۰، آزمایشگاه­های متعدد کشت بافت گیاهی در بسیاری از کشورها در دهه ۱۹۶۰ و ۱۹۷۰ تاسیس شدند. روش­های عمده ازدیاد گیاهان در شرایط کشت درون­شیشه­ای شامل کشت جوانه­های جانبی، تشکیل شاخه نا­بجا و جنین­زایی سوماتیکی است. همچنین استفاده از این روش می­تواند در زمینه­های مختلف مثل نجات جنین، دورگ گیری بدنی، انتقال ژن، تولید گیاهان هاپلوئید، پلی­پلوئیدی، ایجاد جهش و حفظ ذخایر ژنتیکی مفید باشد.

یکی از عوامل دیگری که در ازدیاد محصولات پیازی تاثیر می‎گذارد، کنترل خواب پیاز می‎باشد که هنوز به طور کامل مطالعه نشده است. در بسیاری از گونه‎ها دوره خواب باعث می‎شود که گیاه قادر به تحمل شرایط محیطی شود. در عمل، تنظیم خواب در شرایط درون شیشه‎ای مطلوب بوده و می‎تواند با اعمال تیمار سرمادهی پیازچه‎ حاصل گردد.

گیاهانی که تحت شرایط درون شیشه‎ای پرورش می‎یابند رشد سریع­تری نسبت به حالت طبیعی دارند. در تحقیقی که روی کشت بافت گونه دارویی F. unibracteata صورت گرفته مشخص شده است که میزان رشد گیاهان حاصله ۳ تا ۵ مرتبه بیشتر از شرایط طبیعی می‎باشد.

لاله واژگون کشت بافت

مراحل انجام کشت درون شیشه­ ای

ترکیب محیط

 کربوهیدرات­ها

کربوهیدرات­ها جز بسیار مهمی در هر نوع محیط کشت است. نیاز به کربوهیدرات­ها در شرایط درون شیشه­ای اولین بار توسط گوتریت در سال ۱۹۴۵ با کشت قطعات ریشه هویج مطالعه شد. از آنجا که معمولا در شرایط درون شیشه­ای، انجام فتوسنتز به علت نور پایین، تهویه ناکافی و رطوبت نسبی بالا بخوبی انجام نمی­شود و یا اصولا به علت فقدان کلروفیل کافی در بافت­ها­ی کشت شده و یا قرار دادن آنها در تاریکی، فتوسنتز انجام نمی­شود، لذا اضافه کردن منبع کربنی (هیدرات کربن) در محیط کشت ضروری است.

معمولا در کشت درون شیشه­ای از سوکروز یا قند معمولی به عنوان منبع تامین کننده کربن با غلظت ۱ تا ۵ درصد استفاده می­شود، زیرا این قند توسط گیاه سنتز شده و به صورت طبیعی در گیاه منتقل می­شود.

ریزنمونه­های برخی از گونه­های گیاهی روی محیط­هایی که در آن از ساکارز اتوکلاو شده در مقایسه با محیط کشت­هایی که در آن از ساکارز فیلتر شده استفاده شده بود رشد بهتری نمودند. این نشان دهنده این است که ساکارز در اثر اتوکلاو هیدرولیز می­شود و در نتیجه سلول­ها قادرند از یک منبع گلوکز و فروکتوز آماده استفاده کنند.

نوع و غلظت قند انتخاب شده به نوع و سن مواد گیاهی در حال رشد بستگی دارد. در کشت پروتوپلاست سطح کمتری از کربوهیدرات­ها استفاده می­شود ولی در کشت بساک به مقدار بیشتری از آن مورد نیاز است.

هیدرات­های کربن نه تنها به عنوان منبع کربن در متابولیسم سلول عمل می­کند بلکه نقش مهمی در تنظیم فشار اسمزی محیط ایفا می­نماید. با وجود نقش اسمزی منابع کربنی، در بیشتر پژوهش­ها تنها به جنبه غذایی آن پرداخته شده است در حالی که ترکیب اسمزی آن به میزان زیادی رشد اندام، بافت و سلول را تحت تاثیر قرار می­دهد.

 نمک­های معدنی

مواد معدنی مهمترین گروه مواد غذایی در کشت­های درون شیشه­ای پس از مواد قندی هستند. تعداد زیادی از نمک­های معدنی برای رشد و نمو گیاه لازم هستند. این نمک­ها به صورت پرمصرف و کم­مصرف طبقه­بندی می­شوند. بجز کربن، هیدروژن و اکسیژن، سایر عناصر ضروری که به مقدار نسبتا زیاد برای رشد و نمو بافت­های گیاهی مورد نیاز هستند، اصطلاحا عناصر غذایی پرمصرف (پر نیاز) می­نامند. این عناصر شامل نیتروژن، فسفر، پتاسیم، کلسیم، منیزیم و گوگرد هستند که اغلب به صورت نمک به محیط کشت اضافه می­شوند. میزان نیاز گیاه به این نمک­ها بیشتر از ۰/۵ میلی مول است. غلظت بهینه هر ماده غذایی برای دستیابی به میزان رشد بیشینه، به میزان زیادی بین گونه­های گیاهی متفاوت است.

سلول­های گیاهی برای رشد طبیعی خود علاوه بر عناصر پرمصرف، در مقادیر بسیار جزئی به عناصر کم­مصرف نیز نیاز دارند. عناصر کم­مصرف در کلیه کشت­های گیاهان عالی شامل آهن، منگنز، روی، مس و مولیبدن هستند. میزان نیاز گیاه به این نمک­ها کمتر از ۰/۵ میلی مول است.

آهن مهمترین عنصر کم­مصرف است و به صورت کلات آهن (اتیل دی امین تترااستات آهن) یا FeEDTA مصرف می­شود. کلات آهن  با افزودن FeSO4 به Na2EDTA تشکیل می­شود. غلظت آهن در محیط کشت ۱۰۰ میکرومول یا ۰/۱ میلی­مول است. بنابراین مقدار مصرف آن با توجه به سایر عناصر کم مصرف، قابل توجه است.

 

ویتامین

بیشتر سلول­های گیاهی کشت شده قادرند همه ویتامین­های مورد نیاز خود را بسازند ولی این ویتامین­های ساخته شده کمتر از مقدار مورد نیاز برای این سلول­هاست. بنابراین برای به­دست آوردن رشد بهتر بافت­های گیاهی اغلب لازم است که به محیط­های کشت یک یا چند ویتامین و اسیدآمینه افزوده ­شود. ویتامین­ها به عنوان کاتالیزور فرایندهای متابولیکی به کار می­روند )نوری قنبلانی، ۱۳۷۱؛ خوشخوی، ۱۳۷۷(. ویتامین­هایی که در محیط کشت بافت و سلول به کار می­روند، شامل تیامین (B1)، نیکوتینیک اسید (B3)، پیریدوکسین (B6)، میواینوزیتول، فولیک اسید (M)، ریبوفلاوین (B2)، آسکوربیک اسید (C)، بیوتین (H)، توکوفرول (E) و پانتوتنیک اسید (B12) هستند. از میان این ویتامین­ها عموما تیامین ضروری ­تر است.

میواینوزیتول به­طور معمول در بسیاری از محلول­های ویتامین­دار استفاده می­شود. با آنکه میواینوزیتول یک کربوهیدرات است و ویتامین نیست ولی در مقدار کم باعث تحریک رشد سلول می­شود. اعتقاد بر این است که میواینوزیتول به اسید آسکوربیک و پکتین شکسته می­شود و در ساخته شدن فسفواینوزیتیدها و فسفاتیدیل­ اینوزیتول که نقش مهمی در تقسیم سلول دارد، شرکت می­کند.

 

 آگار

اکثر آزمایش­های کشت بافت روی بستری ثابت صورت می­گیرد و به­طور معمول از یک عامل مولد ژل جهت این کار استفاده می­شود. در کشت­هایی که از محیط کشت مایع استفاده می­شود، بافت غوطه­ور بیشتر به علت فقدان اکسیژن از بین می­رود. برای جلوگیری از چنین حالتی محیط کشت را جامد یا نیمه جامد می­کنند. آگار یکی از مشتقات نوعی علف هرز دریایی است که به صورت آماده وجود دارد و می­تواند به عنوان ماده مولد ژل در اکثر محیط­های کشت استفاده شود.

آگار یک پلی ساکارید با وزن مولکولی بالا است که وقتی به محیط کشت بافت اضافه می­شود، آب محیط را جذب کرده و یک حالت متخلخل و ژله­ای به محیط می­بخشد. در نتیجه تبادل گازها به ویژه اکسیژن و دی­اکسیدکربن به راحتی صورت می­گیرد. غلظت عادی آگار بین ۰/۶ تا ۰/۸ درصد است، اگر غلظت کمتر (۰/۴ درصد) به کار رود، محیط کشت خصوصا زمانی که pH  محیط هم پایین است، خوب سفت نمی­شود. اگر غلظت بالاتر (۱ درصد) انتخاب شود، در این صورت محیط کشت خیلی سفت می­گردد و در نتیجه قرار دادن نمونه در محیط کشت را مشکل می­سازد. افزودن ۰/۸ تا ۱ درصد زغال فعال، سفتی ژل آگار را کاهش می­دهد. در بعضی موارد به جای آگار از موادی مانند فیتاژل، آلژینات، بیوژل و ژل­رایت استفاده می­شود. گاهی به جای آگار می­توان از پل کاغذی روی محیط کشت مایع نیز استفاده کرد.fritillaria-imperialis

 

 pH محیط کشت

میزان  pHمحیط کشت تحت تاثیر ترکیبات (نمک­های غیر آلی، منبع کربوهیدرات­ها، عامل ژلی، زغال فعال و روش نگهداری) و اتوکلاو قرار دارد. میزانpH  محیط بدون ریز نمونه­ها در طی نگهداری در اتاقک رشد به میزان ثابتی کاهش می­یابد و این شاید به علت دهیدراته شدن محیط یا ته­نشین شدن ترکیبات محیط همانند مواد معدنی باشد ولی علت اصلی آن به خوبی مشخص نیست.

عموما pH محیط کشت با NaOH یا HCl (1 تا ۱/۰ مولار) بین  ۵ تا ۶/۵ قبل از اتوکلاو کردن تنظیم می­شود. زیرا pHهای پایین (کمتر از ۴/۵)  و pHهای بالاتر (بالاتر از ۷) عموما در کشت درون شیشه­ای باعث توقف رشد و نمو می­شود. معمولا بعد از اتوکلاو کردنpH  محیط کشت به اندازه ۰/۳ تا ۰/۵ واحد کاهش می­یابد.

 

تنظیم کننده­های رشد گیاهی

هورمون­ها نوعی ترکیبات آلی هستند که به صورت طبیعی در گیاهان عالی ساخته می­شوند و روی رشد و نمو اثر می­گذارند. هورمون­ها معمولا در نقاط مختلف گیاه فعال هستند. علاوه بر این ترکیبات طبیعی، ترکیبات شیمیایی مصنوعی نیز وجود دارند که همانند انواع طبیعی عمل می­نمایند. مجموع هورمون­ها و ترکیبات مشابه شیمیایی تولید شده، تنظیم کننده­های رشد نامیده می­شوند.

پنج گروه از تنظیم کننده­های رشد گیاهی در کشت­ درون شیشه­ای از اهمیت زیادی برخوردار هستند. این تنطیم کننده­ها شامل اکسین­ها، سیتوکنین­ها، جیبرلین­ها، اسید آبسیزیک و اتیلن هستند. مهمترین تنظیم کننده­های رشد در کشت­های درون شیشه­ای، اکسین­ها و سایتوکنین­ها هستند به طوری که نسبت اکسین­ها و سایتوکنین­ها در محیط کشت، می­تواند روند ریشه ­زایی و شاخه­زایی را تحت تاثیر قرار دهد.

سایر اجزا

عوامل محیطی

نور

نور صرف نظر از فراهم کردن منبع انرژی برای فتوسنتز اثرات متعددی روی رشد گیاه دارد. مقدار کربوهیدرات­ها در شدت­های پایین نور یا تاریکی کاهش می­یابد. تغییرات در مقدار هورمون­های داخلی یا سایر ترکیبات فیزیولوژیکی می­تواند با تغییرات شدت، مدت و کیفیت (رنگ یا طول  موج) نور تحت تاثیر قرار گیرد. این تاثیرات ممکن  است در کشت­ها در هر مرحله­ای روی دهد..

فعالیت­های فتوسنتزی در مراحل اولیه رشد گیاهان کشت شده در درون شیشه­ چندان مهم نیست ولی در مراحل بعدی مواد گیاهی کشت شده تا اندازه­ای برای اتوتروف شدن برانگیخته می­شوند. نور برای فرایندهای مورفولوژیکی نظیر آغاز ریشه­زایی و شاخه­زایی و جنین­زایی بدنی بسیار ضروری است. کیفیت نور، شدت نور و فتوپریود برای برخی کشت­ها بسیار تعیین کننده است. نور مناسب توصیه شده برای گیاهان ۳۵ میکرومول بر متر مربع در مجذور ثانیه به مدت ۱۲ تا ۱۶ ساعت در هر ۲۴ ساعت است. پیشنهاد می­شود برای تامین این نور از لامپ­های فلورسنت سفید استفاده شود. لامپ­های آبی باعث تشکیل شاخه­­ ها و نور قرمز القای ریشه­زایی را در بسیاری از گونه­ها به همراه دارد.

 دما

دما از دیگر عوامل مهم در اتاقک رشد است. معمولا میزان درجه حرارت بین ۲۴ تا ۲۶ درجه سانتی­گراد ثابت نگه­داشته می­شود و در بعضی موارد بسته به گونه­های آزمایشی، دمای پایین (۱۸ درجه سانتی­گراد برای گونه­های سوخدار) یا دمای بالاتر (۲۸ تا ۲۹ درجه سانتی­گراد برای گونه­های گرمسیری) انتخاب می­شود.

دمای مناسب برای رشد و نمو در محیط درون شیشه­ای معمولا ۳ تا ۴ درجه سانتی­گراد بیشتر از دمای اتاق رشد است. در شرایط درون شیشه­ای می­توان با استفاده از دمای پایین باعث کند شدن رشد و نمو طبیعی شد و بدین وسیله امکان نگهداری مواد گیاهی در محیط درون شیشه­ای فراهم می­شود.

 

رطوبت نسبی

رطوبت نسبی اتاقک رشد نیز از عوامل موثر در رشد ریز­نمونه است. معمولا رطوبت نسبی اتاقک رشد بین ۴۰ تا ۵۰ درصد تنظیم می­شود. از آنجا که رطوبت در داخل لوله­های آزمایش نسبتا بالاست، رطوبت اتاقک رشد، احتمالا فقط روی تلفات آب از طریق لوله­های آزمایش تاثیر می­گذارد. رطوبت بالا در اتاقک رشد باعث افزایش درصد آلودگی خواهد شد و کاهش آن موجب از دست رفتن آب ریز­نمونه می­شود.

 

تهویه

تهویه مناسب و تامین اکسیژن، عامل مهمی برای رشد سلول­ها و بافت­ها است (باقری و صفاری، ۱۳۸۳). به منظور جلوگیری از آلودگی­های کشت­های استریل، ممانعت از خشک شدن گیاه و محیط غذایی، کشت درون شیشه­ای در ظرف در بسته که تبادل گازی را بین اتمسفر ظرف و هوای بیرون را محدود می­کند، انجام می­شود. رشد گیاهان تحت تاثیر ترکیب محیط غذایی و اتمسفر گازی است. ترکیبات تولیدی توسط گیاه یا سایر بخش­های سیستم ممکن است در اتمسفر ظروف کشت تجمع یابد. مهمترین عامل موثر بر تجمع گازها، نوع و مقدار ماده گیاهی، خصوصیات فیزیکی ظرف و در­پوش آن، محتوای محیط غذایی و وضعیت ماکروکلیما مانند دما، تهویه و شدت نور است.

اتمسفر محیط اساسا شامل ۷۸ درصد نیتروژن، ۲۱ درصد اکسیژن و ۰۳۵/۰ درصد دی­اکسید کربن است. در طول فتوسنتز، گیاهان CO2 مصرف و اکسیژن تولید می­کنند و طی تنفس، CO2 تولید و اکسیژن مصرف می­شود. دی­اکسید کربن و اتیلن و تعدادی دیگر از هیدروکربن­ها در طول کشت تجمع پیدا می­کنند. با افزایش غلظت CO2، کاهش اکسیژن مشاهده می­شود. البته گزارش­هایی مبنی بر کاهش غلظت CO2 در اتمسفر محیط کشت بافت وجود دارد.

مراحل ریزافزایی

در سال ۱۹۷۴ سه مرحله ریزافزایی توسط موراشیگ شرح داده شد. مرحله اول شامل استقرار است که ریز­نمونه در شرایط عاری از عوامل بیماری­زا استقرار می­یابد. مرحله دوم یا مرحله افزونگری مرحله­ای است که شمار ریزنمونه­ها زیاد می­شود. در مرحله سوم عادت دادن گیاهچه برای انتقال به خارج از لوله­های آزمایش آغاز می­گردد.

 

گندزدایی

هدف اولیه از این مرحله دستیابی به درصد زیادی از ریزنمونه­هایی است که از عوامل بیماری­زای سطحی عاری شده­اند. شرایط درون شیشه­ای مانند مقدار بالای مواد غذایی و ساکارز، رطوبت و دمای بالا که برای رشد گیاه مورد نظر مناسب است می­تواند برای رشد میکرارگانیزم­ها نیز مطلوب باشد. به طورکلی گندزدایی سطحی در برگیرنده شستن بافت و در پی آن سترون کردن با یک یا چند ماده گندزدا می­باشد. اساسا چهار منبع آلودگی محتمل است: گیاه (آلودگی داخلی و خارجی)، محیط کشت، هوا و بی­دقتی در حین اجرای کشت. مهمترین منبع آلودگی ممکن است گیاه باشد، بنابراین مواد گیاهی به­لحاظ آنکه دارای طیف وسیعی از آلاینده­های باکتریایی و قارچی است، باید به خوبی قبل از قرار گرفتن در محیط کشت کاملا گندزدایی شود.

برای کاهش آلودگی بهتر است ریزنمونه از اندام­های هوایی گرفته شود. از طرفی آلودگی قسمت­های داخلی گیاه کمتر از بخش­های خارجی آن است، بنابراین پوست سطوح خارجی حتی­الامکان حذف و ریزنمونه از قسمت داخلی تهیه می­شود. به­علاوه هرچه ریزنمونه کوچکتر باشد احتمال آلودگی آن کمتر است.

برای حذف آلودگی­های سطحی ابتدا ریزنمونه باید با آب و صابون شسته شود تا گرد و غبار روی آن برطرف شده و سطح تماس ماده ضدعفونی کننده با ریز نمونه بیشتر گردد. پس از آن با شستن ریزنمونه در زیر آب جاری به مدت ۳۰ دقیقه تا ۲ ساعت به مقدار قابل توجهی میزان آلودگی ریزنمونه­هایی که از مزرعه گرفته شده­اند و همچنین بافت­های کرک­دار، ریشه­ها و اندام­های ذخیره­ای را کاهش می­دهد. پس از شستشو، بافت ریزنمونه در یک محلول گندزدا فرو برده می­شود تا آلودگی­های موجود در سطح آن از میان برود. برای ضدعفونی از الکل ۷۰ درصد برای چند ثانیه استفاده می­شود. الکل ۹۶ درصد خیلی قوی است و باعث دهیدراته شدن شدید می­شود. برای استریل کردن، نمونه به مدت ۱۰ تا ۳۰ دقیقه در هیپوکلریت سدیم یک درصد (NaClO) که دارای چند قطره توین ۲۰ (پلی سوربات) می­باشد، قرار داده و سپس برای از بین بردن اثر هیپوکلریت معمولا سه بار به مدت ۲، ۵ و ۱۵ دقیقه با آب مقطر استریل شستشو می­شود. توین ۲۰ برای حذف حباب­های هوا از مواد گیاهی و شکستن کشش سطحی بین آب و بافت گیاهی مفید است. دیگر گندزداهای مورد استفاده شامل هیپوکلریت کلسیم، پراکسید هیدروژن، نیترات نقره و کلرید جیوه است. برای افزایش تماس ریزنمونه با عامل ضد­عفونی کننده بهتر است محلول حاوی ریزنمونه به طور مداوم تکان داده شود.

سازگاری

شرایط خاص درون شیشه باعث تشکیل گیاهانی با آناتومی، مورفولوژی و فیزیولوژی غیر معمول می­شود. بعد از انتقال این گیاهان به شرایط خارج شیشه، این گیاهان ممکن است خیلی سریع به وسیله تغییرات ناگهانی شرایط محیطی نابود شوند.

قرار گرفتن تدریجی در معرض شرایط طبیعی منجر به سازگاری فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی یعنی مقاوم شدن می­گردد. از جمله این تغییرات، تغییر در خصوصیات اپیدرم، ضخامت برگ، تمایز مزوفیل برگ، تعداد و ساختار کلروپلاست­های برگ، کاهش یافتن تراکم روزنه­ها و تغییر شکل آن­ها از حالت گرد به بیضی است. همچنین کوتیکول برگ­ها و میزان واکس آن­ها و میزان کلروفیل b در طول فرایند سازگاری افزایش می­یابد. از نور کامل در طول مقاوم سازی باید پرهیز شود زیرا تنها قرار گرفتن گیاه­چه­ها به مدت ۱ تا ۲ ساعت در برابر نور خورشید باعث مرگ آن­ها خواهد شد. از دیگر روش­های تسریع سازگاری استفاده از مواد ضد تنفسی مانند اسید آبسایزیک (ABA) و یا افزایش سرعت فتوسنتز با افزایش میزان CO2 است. اعمال سازگاری به ترتیب شامل مراحل زیر است: ۱) شستن ریشه و حذف تمام ذرات ژل (آگار)، ۲) انتقال ریزنمونه ­های ریشه ­دار شده به گلدان حاوی پیت: ورمیکولایت : ماسه به نسبت (۱:۱:۱)، ۳) آبیاری منظم با استفاده از یک افشانه دستی، ۴) نگهداری گیاهان در یک اطاقک مرطوب یا مکان دارای دستگاه رطوبت­ساز با شدت نور کاهش یافته (توسط پارچه یا  تورهای مخصوص) در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد، ۵) کاهش تدریجی رطوبت و افزایش شدت نور در طی چند هفته. در مواقعی هم لازم است  گیاهان را توسط محلول­ های غذایی تغذیه نمود.

 

کشت درون شیشه ای لاله واژگون

به طور کلی گزارشهای کمی در مورد کشت بافت لاله واژگون وجود دارد. عده ای محققان ابتدا تعداد ۲۲ عدد سوخ F.­ imperialis رقم روبرا ماکسیما را ۲ سال کشت نمود تا سوخچه‎های کوچک ایجاد نمایند. سپس جداکشت­هایی را از قسمت­های مختلف آن تهیه کرد. درصد بالایی از جداکشت­ها آلوده و از بین رفتند و درصدی تولید کالوس نمودند. درصدی از کالوسها پس از ۲ ماه تولید سوخچه نمودند. همچنین با کاربرد جداکشت­های برگ، ساقه و نهنج اقدام به تکثیر این گیاه نمود اما درصد باززایی بسیار پایین بود.

در سال ۲۰۰۰ ویتومسکا تاثیر تیمار دمایی را بر ازدیاد درون شیشه­ای  F.­ imperialisمورد بررسی قرار داد. او سوخ­ها را ۸ هفته در دماهای ۴، ۲۲، ۳۰ و ۴۰ درجه سانتی­گراد قرار داد، و گزارش کرد بهترین نتیجه از نگهداری سوخهای مادری در دمای ۳۰ درجه سانتی­گراد به­دست می­آید. همچنین تاثیر دمای اتاقک رشد نیز بر باززایی ریزنمونه ساقه مورد بررسی قرار گرفت. محیط کشت MS همرا با ترکیب هورمون­های رشد به میزان ۱ میلی­گرم ۶ بنزیل آدنین (BA) همراه با ۰/۵ میلی­گرم نفتالین استیک اسید (NAA) و دمای اتاقک رشد ۲۲ درجه سانتی­گراد سوخچه­های مناسب­تری تولید نمود.

اوکاوا و همکاران نیز در سال ۱۹۹۸ کشت بافت F. camtschatcensis  را در ۸ هفته و در دمای ۱۵، ۲۰ و ۲۵ درجه سانتی­گراد مورد بررسی قرار دادند. بهترین شرایط برای تشکیل سوخچه در تیمار تاریکی همراه با ۰/۱ میلی­گرم NAA در دمای ۲۰ درجه سانتی­گراد گزارش شد.

الکساندرا و همکاراندر سال ۲۰۰۷  با مقایسه مقادیر ABA موجود در بافت مادری و توانایی باززایی آن در F.­ imperialis در شرایط آزمایشگاهی به این نتیجه رسیدند که در تمامی مراحل، بیشترین درصد باززایی از مواد گیاهی که دارای کمترین مقادیر ABA آزاد بود، بدست می­آید.

پاک­کی و مورفی در سال ۲۰۰۲ درصد بالایی سوخچه از ریزنمونه­های فلسی F. thunbergii به دست آوردند و این سوخچه­ها بعد از ۱۲ هفته از کشت، تولید برگ و ریشه نمودند. میانگین ۷/۱۷ سوخچه از  فلس­ها درون محیط کشت MS حاوی ۱/۶۲ میکرومول NAA و ۴/۶۵ میکرومول کینتین به­دست آمد. کشت­هایی که در چرخه ۱۶ ساعت روشنایی نور فلورسنت (۴۰ mol m–۲ s–۱) و ۸ ساعت تاریکی در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد نگهداری شدند، نسبت به کشت­هایی که در تاریکی مطلق در دمای ۲۵درجه سانتی­گراد نگهداری شده بودند سوخ­های مطلوب­تری، تولید کردند.

در تحقیقی که روی گونه F. unibracteata  به منظور تولید متابولیت­های ثانویه، صورت گرفت، زمانی­که جداکشت­های فلس در محیط دارای ۴/۴۴ میکرومول BA و ۵/۷۱ میکرومول IAA کشت شدند، مواد دارویی حاصل از سوخچه‎های بدست آمده بیشتر از شرایط طبیعی بود.

در پژوهشی محمدی ده چشمه در سال ۲۰۰۷ با عنوان جنین­زایی غیر­مستقیم از ریزنمونه­های گلبرگ F.­ imperialis نتیجه گرفت که محیط کشت B5 حاویmg/l  ۰/۱ BAP + mg/l  ۰/۶NAA + mg/l  ۰/۴IAA مناسب­ترین تیمار برای تولید سوخچه به تعداد ۵ عدد است.

شیا او و همکاران در سال ۲۰۰۰ تولید انبوه گونه F. hupehensis را همراه با سه نوع ریزنمونه در شرایط درون شیشه­ای مورد بررسی قرار دادند. بیشترین درصد باززایی از ریزنمونه فلس و پس از آن به ترتیب از ریزنمونه ساقه و برگ به­دست آمد. همچنین ۴ میلی­گرم NAA باعث افزایش کالوس­دهی ریزنمونه و بهبود ریشه­زایی سوخچه­های تشکیل شده گردید.

 

مشکل استقرار ریزنمونه لاله واژگون

 حذف آلودگی

بزرگترین مشکل استقرار ریزنمونه لاله واژگون در شرایط درون شیشه­ای حذف آلودگی است. آلودگی­های فوزاریومی، فیتوفترا و آلودگی باکتریایی از مهمترین موانع کشت بافت لاله واژگون هستند. از آنجا که فلسها در تماس با خاک هستند، گندزدایی آنها بسیار مشکل است. روشی که برای کنترل آلودگی در گیاهان سوخ دار همانند سوسن استفاده می‎شود، استفاده از تیمار آب گرم یا بخار آب گرم است. بر اساس پژوهش صورت گرفته در موسسه تحقیقات بیوتکنولوژی کشاورزی، این روش در مورد لاله واژگون کارایی نداشت و استفاده از جداکشت­های غیر از سوخ­ مورد تاکید قرار گرفت.

ویتومسکا و لوکازوسکا در سال ۱۹۹۸ چند روش گندزدایی را بر میزان آلودگی گیاهان و باززایی ریزنمونه­ های سوخ لاله واژگون مورد بررسی قرار دادند. آنها گندزدایی یک مرحله­ای با غلظت­های مختلف کلرآمین T را با گندزدایی دو مرحله­ای کلرآمین T و قارچ کش بنلیت مورد آزمایش قرار دادند. در این بررسی، گندزدایی با کلرآمین T درصد گیاهان سالم را به طور معنی­داری افزایش نداد، در حالیکه استفاده از بنلیت درصد گیاهان گندزدایی شده را افزایش داد اما قابلیت باززایی، رشد و تشکیل ریشه در سوخهای استریل شده کاهش یافت.

در پژوهشی علت به دست نیامدن جداکشت­های سالم را آلوده بودن فلس­های گیاه لاله واژگون به آلودگی داخلی باکتریایی مربوط دانستند و عنوان نمودند که استفاده از سوخ این گیاه به عنوان جداکشت به دلیل وجود آلودگی داخلی حتی با اعمال تیمارهای مختلف از قبیل الکل، هیپوکلریت سدیم، کلرید جیوه و تیمار حرارتی میسر نمی­باشد.

کمبود تعداد فلس

گونه‎ های آسیایی و اروپایی لاله واژگون در مقایسه با گونه‎های آمریکایی دارای سوخهای بزرگ با تعداد بسیار کمتر فلس می‎باشند که بین ۴-۲ عدد متغیر می‎باشد.

 

ضرورت و اهمیت تحقیق

گیاه لاله واژگون از جمله گیاهان در خطر انقراض کشور است که هرساله به دلیل برداشت غیر­قابل کنترل گل و پیاز از رویشگاه­های طبیعی، بیش از پیش در معرض نابودی قرار دارد. روش مرسوم ازدیاد از طریق کشت فلس به علت تعداد کم فلس و در نتیجه محدود بودن نقاط مریستمی و همچنین نیاز به مدت زمان طولانی به مدت ۵-۳ سال، دارای کارایی پایین است. ازدیاد بذری این گیاه نیز به ۷ سال زمان نیاز دارد. کشت درون شیشه­ای می­تواند روشی مناسب برای ازدیاد انبوه گیاه لاله واژگون در زمان کوتاه باشد. در این روش علاوه بر ازدیاد سریع و جلوگیری از انقراض گونه­های در معرض خطر، زمینه برای دستکاری ژنتیکی و اصلاح خصوصیات گل این گیاه و همچنین تولید متابولیت­های ثانویه از طریق کشت کالوس فراهم خواهد شد.

دانلود مقاله استخراج از پایان نامه اینجانب:

اثر تنظیم کننده‌های رشد گیاهی در باززایی مستقیم سوخچه از ریزنمونه فلسی لاله واژگون

منبع: بخشی ازفصل اول  پایان نامه کارشناسی ارشد اینجانب (سعید حمیداوغلی) با عنوان: مطالعه تاثیر نوع ریز نمونه و تنظیم کننده­های رشد بر تکثیر درون شیشه­ ای گل لاله واژگون – تمامی عکس های گیاه لاله واژگون توسط مولف گرفته شده است.

لطفا از مطلب لاله واژگون با درج نام سایت گلساران به عنوان منبع استفاده نمایید.